Expressão do complexo troponina em E. coli e mapeamento dos domínios funcionais da troponina T

• Main Author: Malnic, Bettina
• Other Authors: Reinach, Fernando de Castro
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 1995
• Subjects: Biologia molecular; Complexo troponina; Estrutura de proteínas; Molecular biology; Protein structure; Troponin complex; Troponin T; Troponina T
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-03042012-121955/

A contração muscular esquelética é regulada pelo complexo troponina/tropomiosina de maneira dependente de Ca2+. O complexo troponina consiste de três subunidades: a troponina C (TnC), a troponina I (TnI) e a troponina T (TnT). A troponina C é a subunidade que liga Ca2+, a TnI é a subunidade inibitória e a TnT liga-se fortemente à tropomiosina. A TnI e a TnT são altamente insolúveis a baixas forças iônicas, a não ser que estejam complexadas com a TnC. O complexo troponina pode ser reconstituído \"in vitro\" a partir das subunidades isoladas simplesmente misturando-se as subunidades em razões equimolares em uréia, que depois é removida através de diálise. Na primeira parte deste trabalho um vetor para a co-expressão da TnC, TnI e TnT em E.coli foi construído. Utilizando este vetor nós produzimos um complexo troponina funcional montado no citoplasma de E.coli. A presença da TnT é requerida para regulação dependente de Ca2+ da contração muscular esquelética. O papel da TnT em conferir sensibilidade ao Ca2+ à atividade ATPásica da acto-miosina foi analisado. Mutantes de deleção da TnT foram construídos através de mutação sítio-dirigida e expressos em E.coli. Complexos troponina contendo os mutantes de TnT e/ou mutantes de TnI foram reconstituídos e analisados em ensaios de ligação ao filamento fino e ensaios de atividade ATPásica. Baseado nestes resultados a TnT foi subdividida em três domínios: o domínio ativatório (aminoácidos 157-216), o domínio inibitório (aminoácidos 157-216) e o domínio de ancoragem do dímero TnC/TnI (aminoácidos 216-263). Nós demonstramos que o dímero TnC/TnI está ancorado ao filamento fino através da interação entre a região amino-terminal da TnI e da região carbóxi-terminal da TnT (aminoácidos 216-263). Um modelo para o papel da TnT na regulação da contração muscular dependente de Ca2+ é proposto. === The contraction of skeletal muscle is regulated by troponin and tropomyosin in a Ca2+ dependent manner. The troponin complex consists of three subunits: troponin C (TnC), troponin I (TnI) and troponin T (TnT). Troponin C is the Ca2+ binding subunit, TnI is the inhibitory subunit and TnT binds tightly to tropomyosin. TnI and TnT are highly insoluble proteins at low ionic strengths, unless they are complexed with TnC. The troponin complex can be reconstituted \"in vitro\" from the isolated subunits simply by mixing the subunits at equimolar ratios in urea, which is then removed by dialysis. In the first part of this work a vector for the co-expression of TnC, TnI and TnT in E.coli was constructed. Using this vector we were able to produce a functional troponin complex assembled \"in vivo\" in the E.coli cytoplasm The presence of TnT is required for the Ca2+ dependente regulation of the skeletal muscle contraction. The role of TnT in conferring full Ca2+ sensitivity to the ATPase activity of acto-myosin was analyzed. Deletion mutants of TnT were constructed by site-directed mutagenesis and expressed in E.coli. Troponin complexes containing the TnT deletion mutants and/or TnI deletion mutants, were reconstituted and analyzed in thin filament binding assays and in ATPase activity assays. Based on these studies, TnT was subdivided into three domains: the activation domain (comprised of aminoacids 1-157), the inhibitory domain (comprised of amino acids 157-216) and the TnC/TnI dimer anchoring domain (aminoacids 216-263). We demonstrated that the TnC/TnI is anchored to the thin filament through interaction between the amino-terminal domain of TnI and the region comprised of aminoacids 216-263 of TnT. A model for the role of TnT in the Ca2+ dependent regulation of muscle contraction is proposed.