O papel funcional do miR-155 no controle pós-transcricional de mRNAs envolvidos no desenvolvimento de timócitos

• Main Author: Felício, Rafaela de Freitas Martins
• Other Authors: Passos Junior, Geraldo Aleixo da Silva
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2016
• Subjects: Desenvolvimento de timócito; Development thymocyte; electro-transfection and Anti-miR-155; eletrotransfecção e AntimiR-155; miR-155
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17147/tde-06062017-160544/

O timo é um órgão linfóide primário, responsável pela indução da tolerância imunológica central. Histologicamente esse órgão é formado por um estroma composto por células tímicas epiteliais (TECs) além de outros tipos celulares. Dentre as TECs encontramos as células tímicas epiteliais corticais (cTECs) e as células tímicas epiteliais medulares (mTECs), as quais são responsáveis pela seleção positiva e seleção negativa dos timócitos em desenvolvimento, respectivamente. Durante seu desenvolvimento intra-tímico, os timócitos modulam da expressão de genes de marcadores de diferenciação, os chamados clusters de diferenciação (CDs) além de outros genes. Neste projeto nós nos interessamos por este aspecto, ou seja, o controle da expressão gênica durante a diferenciação dos timócitos. Como os microRNAs (miRNAs) são elementos essenciais de controle fino da expressão gênica, atuando ao nível pós-transcricional de RNAs mensageiros (mRNAs) de células eucarióticas, nosso interesse foi o de estudar este tipo de controle em timócitos. Dentre as centenas de miRNAs já descritos no camundongo, o miRNA 155 (miR-155) é o mais expresso no timo e no baço sendo que seu papel foi já foi demonstrado em células T maduras periféricas, mas ainda não se estudou seu possível papel em timócitos em desenvolvimento. A partir das evidências do papel do miR-155 nas células T maduras, nós elaboramos a hipótese de que esse miRNA também atua no desenvolvimento de timócitos. Para testar essa hipótese, nós utilizamos a estratégia de silenciamento do miR-155 por meio de eletroporação (eletrotransfecção) do antagonista Anti-miR-155 diretamente no timo de camundongos BALB/c. Os timócitos de camundongos controle e silenciados foram então separados por citometria de fluxo e amostras de RNA dessas células foram então analisadas por meio de qRT-PCR para nos certificarmos da eficiência do silenciamento do miR-155 e por hibridizações com microarrays de mRNAs para a análise do transcriptoma. Observamos que o silenciamento do miR-155 provoca a modulação de um grande conjunto de mRNAs, os quais foram analisados com auxílio do banco de dados do \"Immunogical Genome Project\" (ImmGen) quanto aos seus aspectos funcionais focando no desenvolvimento de timócitos. Os mRNAs modulados e envolvidos neste processo, foram ainda reanalisados quanto sua capacidade de interagir por hibridização com o miR-155 (hibridização miRNA-mRNA) por meio da ferramenta computacional RNA-Hybrid. Por meio destas estratégias, conseguimos repertoriar um conjunto de mRNAs que codificam proteínas importantes para o desenvolvimento de timócitos e que são potencialmente controlados por miR-155. === The thymus is a primary lymphoid organ responsible for the induction of central immune tolerance. Histologically this organ is formed by a thymic stroma composed of thymic epithelial cells (TECs) and other cell types. The TEC cells are subdivided into cortical thymic epithelial cells (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs), which are responsible for positive selection and negative selection of developing thymocytes, respectively. During its intra-thymic development, thymocytes modulate the gene expression of differentiation markers, so-called clusters of differentiation (CD) and other genes. In this project we are interested in the control of gene expression during the differentiation of thymocytes. As microRNAs (miRNAs) are essential elements of fine control of gene expression, acting at the post-transcriptional level of messenger RNAs (mRNAs) of eukaryotic cells, our interest was to study this type of control in thymocytes. Among the hundreds of miRNAs been described in mice, miRNA 155 (miR-155) is strongly expressed in the thymus and spleen and its role was already demonstrated in peripheral mature T cells, but has not yet been studied during the thymocyte development. Taking into account the evidence for the role of miR-155 in mature T cells, we raise the hypothesis that this miRNA is also active in developing thymocytes. To test this, we use the miR-155 silencing strategy by using electroporation (electrotransfection) of anti-miR-155 antagonist directly into the thymus of BALB/c mice. The thymocytes of control or silenced mice were then separated by flow cytometry and RNA samples from these cells were initially analyzed by qRT-PCR to make sure of miR-155 silencing efficiency and then by hybridization with microarrays for mRNA transcriptomeanalysis. We note that miR- 155 silencing cause modulation of a large set of mRNAs, which were analyzed through \"Immunological Genome Project\" (ImmGen) database focusing on developing thymocytes. The modulated mRNAs that were involved in this process were also retested for their ability to interact with miR-155 (miRNA-mRNA hybridization) by means of RNA-Hybrid computational tool. Through these strategies we were able to found a set of mRNAs encoding proteins important for the development of thymocytes that are potentially controlled by miR-155.