Purificação e caracterização das β-glicosidases digestivas de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera)

• Main Author: Marana, Sandro Roberto
• Other Authors: Terra, Clelia Ferreira
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 1999
• Subjects: Beta-glicosidases; Beta-glucosidase; Beta-glucosidases; Beta-glycosidases; Enzimas; Enzymes; Spodoptera frugiperda
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-08082008-130612/

Foram purificadas através de uma combinação de cromatografias as duas &#946;- glicosidases digestivas (Mr 47.000 e 50.000 - denominadas &#946;47 e &#946;50, respectivamente) encontradas na larva de S. frugiperda. Experimentos de competição entre substratos e modificação química mostraram que a &#946;47 possui dois sítios ativos. Um desses sítios denominado aril&$946;glicosidase apresenta um subsítio -1 que liga galactose mais eficientemente do enquanto ,que o subsítio +1 prefere pequenos grupos hidrofóbicos cíclicos. O segundo sítio, denominado celobiase, possui um subsítio -1 que prefere glicose. Já a região de ligação do aglicone apresenta 4 subsítios, que ligam glicose com afinidade decrescente à medida que afastam-se do ponto de clivagem do substrato. O cDNA que codifica a &#946;50 foi clonado e sequenciado. Alinhamentos de sequência de aminoácidos, experimentos de competição entre substratos e inibição mostraram que esta enzima possui apenas um sítio ativo. O subsítio -1, cuja especificidade é controlada por uma rede de pontes de hidrogênio, foi estudado comparando-se os parâmetros cinéticos (Kcat e KcaUKm) para a hidrólise de NP&#946;glicosídeos. A região de posicionamento do aglicone, uma fenda hidrofóbica composta de 3 subsítios, foi caracterizada utilizando-se alquil &#946;-glucosídeos e oligocelodextrinas como inibidores. O alinhamento da sequência de aminoácidos da &#946;50 com outras glicosil hidrolases sugeriu quais aminoácidos participariam da ligação do substrato e que o GlU187 (doador de prótons - pKa = 7,5) e o GIU399 (nucleófilo - pKa = 4,5) estão diretamente envolvidos na catálise. Além disso, a Arg97 e a Tyr331 participam indiretamente modulando o pKa do GIU399. r . === Two digestive &#946;-glycosidases (MW 47,000 and 50,000, named &#946;gly47 and &#946;gly50, respectively) whose are found in the S. frugiperda larvae were purified by a combination of chromatographic steps. Substrate competition experiments and chemical modification data showed that &#946;gly47 has two active sites. One of them was called aryl &#946;-glycosidase and presents a -1 subsite that prefers galactose while the +1 subsite binds small cyclic hydrophobic groups. The other active site was called cellobiase and presents 4 subsites that bind glucose residues weaker as they get far from the cleavage point. The cDNA that codes the &#946;gly50 was cloned and sequenced. Amino acid sequence alignment, substrate competition experiments and inhibitions proved that this enzyme has just one active site. The -1 subsite specificity is controlled by a hydrogen bond network as it was showed comparing the kinetic parameters (Kcat and KcatlKm) for some NP&#946;glycosides hydrolysis. The aglycone binding region, a hydrophobic cleft, was studied with alkyl &#946;-glucosides and oligocellodextrins as competitive inhibitors. Amino acid sequence alignment between the &#946;gly50 and other glycosil hydrolases showed the amino acids responsible for the substrate binding and that the GIU<SUB.187 (proton donor - pKa = 7.5) and GIU399 (nucleophile - pKa = 4.5) are directly involved in the catalysis. Beside this, Arg97 and Tyr331 participate indirectly in the catalysis, modulating the nucleophile pKa