Estudo da interação entre ácidos graxos e Lys49-fosfolipases A2 por difração de raios X e ressonância magnética nuclear

• Main Author: Ambrósio, André Luís Berteli
• Other Authors: Garratt, Richard Charles
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2003
• Subjects: Não disponível; Not available
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-19082014-161827/

Fosfolipases A2 (PLA2; E.C. 3.1.1.4) constituem uma família de enzimas amplamente estudada com o objetivo de se caracterizar as bases estruturais de suas propriedades tóxicas e catalíticas. Nos últimos anos, muita atenção tem sido direcionada às PLA2 miotóxicas e cataliticamente inativas (classe II, ~ 15 Kda), nas quais um dos ligantes do cofator Ca2+, o resíduo Asp49, é sistematicamente substituído por uma lisina. Estudos recentes mostram que essas variantes apresentem atividade catalítica limitada, uma vez que um dos produtos, uma molécula de ácido graxo, não deixa o sítio ativo após a catálise, devido à presença da Lys122 que de maneira indireta, segura eletrostaticamente o grupo acídico desta molécula. Cristais da Miotoxina ACL (extraída do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus), crescidos no grupo espacial P41212, foram obtidos em três condições diferentes. Dados de difração de raios X para cristais das primeiras e segundas formas foram coletados usando radiação síncrotron na linha PCr do LNLS e para cristais da terceira forma foram coletados no sistema de ânodo rotatório ultraX 18 em nosso laboratório. O processamento dos dados foi realizado e uma solução para a substituição molecular das duas primeiras formas foi encontrada usando a também Lys49-PLA2 da serpente Agkistrodon p. piscivorus como modelo de busca. Para resolução da terceira forma foram usadas informações do espalhamento anômalo dos átomos de enxofre da molécula, com dados coletados à um comprimento de onda correspondente a radiação Kα do cobre. Ciclos sucessivos de refinamento, tanto no espaço recíproco como no real, foram realizados, e a existência de uma densidade eletrônica dentro do sítio ativo na forma I sugere a presença de uma molécula de ácido graxo, não observada nas outras duas formas. Comparações entre as três formas demonstram que modificações envolvendo o loop de ligação de cálcio e o C-terminal são as responsáveis pelas diferenças estruturais principais, uma vez que nas duas últimas formas, a His33 ocupa o lugar da Lys122 na primeira forma e o Trp31 oclui parcialmente o sítio de ligação do ácido graxo. Essa é a primeira vez que são observadas três formas estruturalmente diferentes para uma Lys49-PLA2. Neste trabalho propomos um mecanismo relacionando a retenção do ácido graxo com mudanças conformacionais associadas à danos em membranas e miotoxicidade === Phospholipases A2 (PLA; E.C. 3.1.1.4) constitute a family of enzymes which has been widely studied with a view to the clarification of the structural basis of their catalytic properties and toxicity. In recent years much attention has been directed toward studies of catalytically inactive myotoxic PLA2 (class II, ~ 15 KDa), in which one of the ligands of the essential ion Ca2+, Asp49, is substituted by a lysine. Recent studies have shown that the Lys49 variants may present limited catalytic activity but that one of the products, fatty acid, does not leave the active site after catalysis due the presence of Lys122 which indirectly electrostatically secures the acidic headgroup. Crystals of the Myotoxin ACL (from Agkistrodon contortrix laticinctus), in the space group P41212, were obtained in three different conditions. Data form the best crystals of the first and second forms were collected using synchrotron radiation on the PCr beamline of the LNLS and the data set for the third crystal form was collected on an ultraX 18 rotating anode system in our own laboratory. Data processing was performed and a molecular replacement solution for the two first forms found using the Lys49-PLA2 of the Agkistrodon p. piscivorus as a search model. Sulfur-SAD at the Cu-Kα wavelength was used to solve the structure of the third form. Cycles of refinement in both reciprocal and real space have been undertaken, and the presence of an electron density residing in the active site channel of the first crystal form suggests the presence of a bound ligand (interpreted as a free fatty acid), not observed in the second and third crystal forms. Comparisons suggest that a concerted conformational change involving the exit to the Ca2+ binding loop and the C-term loop represents the principal structural differences between the crystal forms. Fatty acid binding in the second two forms is impeded as a consequence of His33 occupying the site occupied by Lys122 in the first form and by Trp31 which partially occludes the fatty acid binding site. This is the first time that three crystal structures have been described for a Lys49-PLA2 in both the bound and unbound conformations. In this work we propose a mechanism relating fatty acid retention to conformational changes associated with membrane damage and myotoxicity