Characterization of genes involved in lignin biosynthesis in Tectona grandis

• Main Author: Gómez, Esteban Galeano
• Other Authors: Carrer, Helaine
• Format: Others
• Language: en
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2015
• Subjects: Bioinformática; Bioinformatics; Fatores de transcrição; PCR em tempo real; Phenylpropanoid pathway; Quantitative real-time PCR; RNAseq; Secondary xylem; Transcription factors; Via fenilpropanóide; Xilema secundário
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11151/tde-30042015-153939/

Teak tree (Tectona grandis L.f.) has a high value in the timber trade for fabrication of woody products due to its extraordinary qualities of color, density and durability. Despite the importance of this species, genetic and molecular studies available are limited. Also, the lack of molecular information about secondary xylem and tree maturation has hindered genetic exploration of teak. Therefore, gene expression studies and transcriptomic profiling are essential to explore wood formation and lignin biosynthesis through the development and aging of vascular plants. Aiming the gene expression studies, it was essential to identify and clone reference genes for teak. Eight genes were tested, commonly used in qRT-PCR, including TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ and TgEF1a. Expression profiles of these genes were evaluated by qRT-PCR in six tissue and organ samples (leaf, flower, seedling, root, stem and branch secondary xylem). Stability validation by NormFinder, BestKeeper, geNorm and Delta Ct programs showed that TgUBQ and TgEF1a are the most stable genes to use as qRT-PCR reference genes in teak in the conditions tested. Due to the availability of 12- and 60-year-old teak trees, RNA-seq was performed in diferent organs (seedlings, leaves, flowers, root, stem and branch secondary xylem). A total of 462,260 transcripts were obtained by assembling with \"Trinity\" software. Also, 1,502 and 931 genes differentially expressed were identified for stem and branch secondary xylem, respectively, using DESeq program, and MYB transcription factors, which were characterized. TgMYB1 amino acid sequence displayed a predicted coiled-coil (CC) motif while TgMYB2, TgMYB3 and TgMYB4 showed R2R3-MYB domain. All of them were phylogenetically grouped with several gymnosperms and flowering plants. High expression of TgMYB1 and TgMYB4 in lignified tissues of 60-year-old trees was observed. In this work, the Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) gene family was also studied. One complete (TgCAD1) and three partial (TgCAD2 to TgCAD4) members were characterized. The four enzymes presented residues for catalytic and structural zinc action, NADPH binding and substrate specificity, consistent with the mechanism of alcohol dehydrogenases. TgCAD3 and TgCAD4 were highly expressed in young and mature sapwood and seem to be duplicated and highly related with lignin biosynthesis. Tree genetic improvement, marker-assisted selection and plant transformation seem to be promising lines of research for the data obtained from this research. This is the first study addressing gene characterization and expression, phylogeny and transcriptomic profiling in teak. === A árvore de teca (Tectona grandis L.f.) tem alto valor no comércio de madeira para a fabricação de produtos lenhosos, devido às suas qualidades extraordinárias de cor, densidade e durabilidade. Apesar da importância desta espécie, são poucos os estudos genéticos e moleculares disponíveis. Também, a falta de informação molecular sobre xilema secundário e maturação da árvore tem dificultado a exploração genética de teca. Assim, estudos de expressão gênica e perfis transcricionais são relevantes para explorar a formação da madeira e a biossíntese de lignina durante o desenvolvimento e envelhecimento das plantas vasculares. Visando os estudos de expressão gênica, foi essencial identificar e clonar genes de referencia para a teca. Foram testados oito genes comumente usados em qRT-PCR, TgRP60S, TgCAC, TgACT, TgHIS3, TgSAND, TgTUB, TgUBQ e TgEF1a. Perfis de expressão destes genes foram avaliados por qRT-PCR em seis amostras de tecidos e órgãos (folhas, flores, plântulas, raiz, xilema secundário de caule e ramo). A validação da estabilidade pelos programas NormFinder, BestKeeper, geNorm e Delta CT mostrou que TgUBQ e TgEF1a são os genes mais estáveis para usar como genes de referência em teca nas condições testadas. Em virtude da disponibilidade de árvores de teca de diferentes idades, entre 12 e 60 anos, foi realizado o RNAseq de diferentes órgãos (plântulas, folhas, flores, raiz, ramos e caules de árvores de 12 e 60 anos). Obteve-se um total de 462.260 transcritos pela montagem com o software \"Trinity\". Foram identificados 1.502 e 931 genes diferencialmente expressos para xilema secundário de caule e ramo, respectivamente, utilizando o programa DESeq e fatores de transcrição MYB, que foram posteriormente caracterizados. A sequência de aminoácidos do TgMYB1 exibiu um motivo \"coiled-coil\" (CC), enquanto TgMYB2, TgMYB3 e TgMYB4 mostraram domínio R2R3-MYB. Todos eles foram filogeneticamente agrupados com várias gimnospermas e angiospermas. Observou-se alta expressão do TgMYB1 e TgMYB4 em tecidos lignificados de árvores de 60 anos de idade. Neste trabalho também foi estudada a família gênica Cinamil álcool desidrogenase (CAD). Foi caracterizado um membro completo (TgCAD1) e três parciais (TgCAD2 a TgCAD4). As quatro enzimas apresentaram resíduos de ação catalítica e estrutural de zinco, de ligação ao NADPH e de especificidade de substrato, em conformidade com o mecanismo conservado de álcool desidrogenases. TgCAD3 e TgCAD4 foram altamente expressos no alburno jovem e maduro e parecem estar duplicados e relacionados com a biossíntese de lignina. O melhoramento genético de árvores, a seleção assistida utilizando marcadores moleculares e a transformação de plantas parecem ser linhas promissoras de pesquisa, a partir dos dados obtidos nesta pesquisa. Este é o primeiro estudo sobre caracterização e expressão gênica, filogenia e perfis transcricionais em teca.