Produção, liofilização, purificação e determinação de especificidade da peptidase isolada do fungo Scopulariopsis koningii

• Main Author: Giovanini, Gabriel Tescarolo
• Other Authors: Cabral, Hamilton
• Format: Others
• Language: pt
• Published: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP 2014
• Subjects: bioprocesses; bioprocessos; biotechnology; biotecnologia; enzimologia; enzymology; liofilização; lyophilization; peptidase
• Online Access: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-30102014-144336/

Peptidase pode ser considerada, como uma subclasse das enzimas hidrolíticas que ocupam uma posição central em relação às suas aplicações na área fisiológica e também na área comercial. As peptidases representam um dos três maiores grupos de enzimas industriais e são responsáveis por cerca de 60% da venda mundial de enzimas. O presente trabalho visa avaliar a produção de peptidase em fermentação submersa (FSm) pelo fungo Scopulariopsis koningii, utilizando como substrato farinha de pena (FP), a caracterização bioquímica parcial, secagem do extrato bruto, purificação da peptidase e determinação de especificidade da peptidase isolada. Para avaliar a influência da farinha de pena (FP), na produção de peptidases, foram adicionadas às porcentagens de 0,2; 0,4 e 0,8% no meio de cultura. Os melhores níveis de produção de peptidases pelo fungo Scopulariopsis koningii foram obtidos nas concentrações de 0,4% e 0,8% de FP em 48h de fermentação com 1.427 U/mL. A caracterização bioquímica parcial do extrato bruto foi realizada com azocaseína 1% preparada em tampão com pH adequado. A peptidase presente no extrato enzimático apresentou atividade ótima em pH 6,5 e temperatura ótima de 55°C. A peptidase foi inibida por PMSF, indicando a presença de resíduo de aminoácido serino no sítio catalítco, e desta forma sendo classificada como serino peptidase. Entretanto, também observamos uma inibição por EDTA, sugerindo a presença de uma metalo peptidase presente no extrato bruto, desta forma podemos sugerir que o fungo S. koningii na presença do meio contendo FP secreta duas subclasses; serino e metalo peptidase, ou secreta uma serino peptidase dependente de íon. Zimograma constatou a presença de duas enzimas. A atividade enzimática do extrato bruto diminuiu significativamente quando exposta os íons Al+3, Ni2+ e Cu2+ e aumentada quando adicionados os íons Ba2+, Ca2+ e Mg2+. A purificação da metalo peptidase presente no extrato enzimático envolveu sete etapas de purificação, sendo cromatografia de troca-iônica e gel filtração determinantes, com recuperação de 6% e purificação de 3,4 vezes. Utilizando a peptidase pura (metalo) realizouse a caracterização bioquímica funcional e a determinação dos parâmetros cinéticos, ambos utilizando o substrato peptídico de supressão intramolecular de fluorescência. A peptidase pura apresentou atividade ótima em pH 6,0 e temperatura ótima de 40°C e mostrou-se estável em ampla faixa de pH e temperatura. Foi modulada positivamente pelos íons Na+ e K+ e negativamente por Al3+ e Cu2+. A análise dos parâmetros cinéticos revelou uma grande influência de aminoácidos apolares do lado \"linha\" do substrato sintético na eficiência catalítica e no lado não \"linha\" grande influência de aminoácidos polares neutros e apolares. A secagem foi realizada por liofilização foram utilizados três tipos de adjuvantes: maltodextrina, manitol e glicina, em diferentes concentrações. Após a secagem foi realizado estudo da estabilidade nas temperaturas 4, 25 e 60°C por 32 dias para avaliar o desempenho dos adjuvantes na manutenção da atividade do extrato enzimático liofilizado. O adjuvante considerado mais eficaz foi a maltodextrina na concentração de 4,5% que manteve cerca de 93% da atividade do extrato enzimático liofilizado por 32 dias. === Peptidase can be considered as a subclass of hydrolytic enzymes which occupy a central position in relation to their applications in physiological area and also in the commercial area. Peptidases represent one of the three largest groups of industrial enzymes and account for about 60% of worldwide sales of enzymes. This study aims to evaluate the production of peptidase in submerged fermentation (FSm) by the fungus Scopulariopsis koningii, using as substrate feather meal (FP), the partial biochemical characterization, drying the crude extract, purification and determination of specific peptidase peptidase isolated. To evaluate the influence of feather meal (FM), in the production of peptidases, were added to the percentages of 0.2, 0.4 and 0.8% in the culture medium. The best levels of production of peptidases by the fungus Scopulariopsis koningii were obtained at concentrations of 0.4% and 0.8% of FP 48h fermentation with 1,427 U/mL. Partial biochemical characterization of the crude extract was performed with 1% azocasein prepared in buffer with appropriate pH. This in peptidase enzyme extract showed optimal activity at pH 6.5 and optimum temperature of 55°C. The peptidase was inhibited by PMSF, indicating the presence of a serine residue at amino acid catalytic site, and thus being classified as serine peptidase. However, we also observed an inhibition by EDTA, suggesting the presence of a metallo peptidase present in the crude extract, thus we suggest that the fungus S. koningii in the presence of medium containing secret FP two subclasses; serine peptidase and metal, or secretes a serine peptidase dependent ion. Zymogram found the presence of two enzymes. The enzymatic activity of the crude extract decreased significantly when exposed the Al 3+, Ni 2+ and Cu2+ ions and increased when added to Ba2+, Ca2+ and Mg2+ ions. The purification of metallo peptidase present in the enzyme extract involved seven stages of purification, and ion-exchange chromatography and gel filtration determinants, with recovery and purification of 6 % from 3.4 times. Using pure peptidase (metallo) held functional biochemical characterization and determination of kinetic parameters using both the intramolecular peptide substrate fluorescence suppression. Pure peptidase showed optimal activity at pH 6.0 and optimum temperature of 40°C and was stable in a wide range of pH and temperature. The positively modulated by Na+ and K+ and negatively by Al3+ and Cu2+. Analysis of kinetic parameters revealed a strong influence of nonpolar amino acid side \"line\" of the synthetic substrate in the catalytic efficiency and not on the side \"line\" great influence of nonpolar and polar neutral amino acids. The freeze drying was performed by three types of additives were used: maltodextrin, mannitol and glycine in different concentrations. After drying stability study was conducted at the temperatures 4, 25 and 60°C for 32 days to evaluate the performance of additives in maintaining the activity of the enzyme extract lyophilized. The adjuvant was found more efficacious maltodextrin in a concentration of 4.5%, which retained about 93% of the extract lyophilized enzyme activity for 32 days.