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Previous issue date: 2017-09-14 === Milk-clotting proteases are important enzymes used in the dairy industry. Due to the
increasing demand for cheese production, the increase in the price of animal rennet and
cultural issues, the search for alternative coagulating sources, among them microbial, is
necessary. The objective of this work was to investigate the production of coagulant
proteases by Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 by the fermentation technology for the
elaboration of cheese with macrofungo biomass. The culture was reactivated, authenticated
and evaluated for the production of aflatoxins in solid medium. The inoculum medium was
selected using SAB+GLI, SAB+SAC, BDA+GLI and BDA+SAC. The liquid fermentation
medium was selected from a base saline solution (MA01). In the other media, 1% (w/v)
glucose (MAGLi) and 1% (w/v) sucrose (MASac), respectively, were added. At the end of
the fermentation, the biomass was separated from the crude extract by vacuum filtration.
The medium and inoculum in which the best milk coagulant activity was determined were
used to optimize the production of coagulant enzymes: carbon and nitrogen sources,
inoculum age and size, fermentation time, temperature, agitation and initial pH of the
medium. The enzymes of the selected crude extract were characterized as to pH and
temperature (optimum activity and stability) and effect of inhibitors. In vitro cytotoxicity
testing was also performed with the test on human fibroblasts and commercial sheep blood.
At the end of the characterization, a cheese supplemented with mushroom biomass
(Pleurotus ostreatoroseus) was elaborated and the physical-chemical and microbiological
analyzes of the product were determined. The culture medium of the inoculum and
fermentation medium that promoted higher milk coagulant activities were BDA+SAC and
MA01, respectively. The milk coagulant enzymes were best produced in submerged
fermentation medium according to the following parameters: age (5 days) and inoculum
size (106 spores per ml medium), initial pH of the medium (pH 7), fermentation (3 days),
fermentation temperature (30°C), stirring (150 rpm), carbon source (0.1% (w/v) starch and
nitrogen (peptone 0.1% (w/v)). According to the proteolytic activity, the enzymes presented
optimum activity at pH 7 at 50 °C. They were stable up to 40 °C and pH 5 to 9. The Zn2+
and Cu2+ ions promoted the greatest reduction of activity and iodoacetic acid was the
inhibitor of higher interference. For the milk coagulant activity, the enzymes were more
active at pH 7 and temperature of 45 °C. They remained stable from pH 5 to 9 and
temperature from 25 to 55 °C. Zn 2+ and K + promoted increased activity and again
iodoacetic acid was the inhibitor of greater interference, characterizing the enzymes as
cysteine protease. There was no detection of toxicity according to the tests. The
microbiological analisys is in agreement with the vigent legislation. The cheeses presented
increasing in the amount of carbohidrates, protein, ashes and humidity according to the
increasing of mushroom concentration. However, was also observed that the increasing in
mushrrom concentration promoted the decreasing in the amount of lipids and also the total
energy Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 has potential as microbial source of milkclotting
enzymes and can be used in dairy industry to cheese manufacturing. === As proteases coagulantes do leite são importantes enzimas utilizadas na indústria de
laticínios. Devido à crescente demanda para a produção de queijo associada ao aumento do
preço do coalho animal e a questões culturais, as fontes coagulantes microbianas são
alternativas ecologicamente viáveis. Esta pesquisa foi realizada para investigar a produção
de proteases coagulantes por Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 e elaboração de queijo
adicionado de biomassa de cogumelo comestível. Aspergillus foi reativado, autenticado e
avaliado quanto à produção de aflatoxinas em meio sólido. Na escolha do meio sólido para
cultivo do inóculo foi utilizado ágar glicose, peptona e extrato de levedura (SAB+GLI);
ágar sacarose, peptona e extrato de levedura (SAB+SAC); ágar batata e glicose
(BDA+GLI); e ágar batata e sacarose (BDA+SAC). Para selecionar o meio líquido para
obtenção do inóculo e para produção do coagulante por fermentação submersa, os cultivos
foram realizados em solução salina (MA01) formulada, separadamente, com glicose 1%
(p/v) (MAGLi) e; sacarose 1% (p/v) (MASac), respectivamente. Ao término da
fermentação, a biomassa foi separada do extrato bruto por filtração a vácuo. Nos meios de
cultura selecionados foi realizada a produção de enzimas coagulantes para avaliar a
influência das fontes de carbono e nitrogênio, idade e tamanho do inóculo, tempo de
fermentação, temperatura, agitação e pH inicial do meio. O extrato bruto selecionado, de
acordo com a atividade coagulante, foi caracterizado quanto ao pH e temperatura (atividade
ótima e estabilidade) e efeito de íons metálicos e inibidores. Depois do processo de
caracterização esse extrato bruto foi avaliado quanto à citoxicidade in vitro com o teste em
fibroblastos humanos e sangue de carneiro comercial. O queijo foi elaborado com o
coagulante caracterizado e adicionado de biomassa de cogumelo comestível (Pleurotus
ostreatoroseus). Ao término do processamento, o queijo foi analisado quanto à qualidade
nutricional e microbiológica. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os
resultados revelaram que Aspergillus flavo furcatis DPUA 1608 expressou fenótico típico
da espécie e não sintetizou aflatoxinas em meio sólido. BDA+SAC e MA01,
respectivamente, foram os meios de inóculo de cultivo submerso que promoveram maiores
atividades coagulantes do leite. As condições que influenciaram na produção das enzimas
coagulantes foram: inóculo com 5 dias de cultivo em meio sólido e, no meio de
fermentação, suspensão celular de 106 esporos/mL de meio; pH 7; 3 dias de cultivo; 30°C;
150 rpm. As melhores fontes de carbono e nitrogênio foram amido 0,1% (p/v) e peptona
0,1% (p/v), respectivamente. As proteases apresentaram atividade ótima em pH 7, a 50°C.
Elas foram estáveis até 40°C e em pH 5 ao 9. Os íons Zn2+ e Cu2+ promoveram a maior
redução da atividade e ácido iodoacético foi o inibidor de maior interferência. As enzimas
coagulantes do leite foram mais ativas em pH 7, 45°C e se mantiveram estáveis em pH 5 a
9, de 25 a 55°C. Os íons Zn2+ e K+ promoveram aumento da atividade e novamente ácido
iodoacético foi o inibidor de maior interferência, caracterizando as enzimas como cisteína
proteases. Tais enzimas não expressaram toxicidade. A análise microbiológica está de
acordo com a legislação vigente. Os queijos produzidos apresentaram aumento do conteúdo
de carboidratos, proteínas, cinzas e umidade associados à concentração do basidioma
adicionado na massa do queijo. O aumento da concentração do cogumelo promoveu a
redução do conteúdo de lipídeos e valor energético total. Aspergillus flavo furcatis DPUA
1608 tem potencial como coagulante de fonte microbiana para aplicação na fabricação de
queijo.
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