Efecto de la aplicación de pulsos eléctricos de alta intensidad de campo y agentes antimicrobianos sobre Staphylococcus aureus en leche

• Main Author: Sobrino López, Ángel
• Other Authors: Martín Belloso, Olga
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Universitat de Lleida 2009
• Subjects: conservació; anàlisis; llet; camps elèctrics; Tecnologia d'Aliments; 62; 663/664
• Online Access: http://hdl.handle.net/10803/8399; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:9788469408179

La llet s'ha processat tradicionalment mitjançant mètodes tèrmics que permeten assegurar la seva qualitat microbiològica i estabilitat enzimàtica. Malgrat això, els canvis organolèptics i la pèrdua de components nutritius induïts pel mateix escalfament podrien minimitzar-se gràcies a la utilització de mètodes no tèrmics de tractament, com els polsos elèctrics d'alta intensitat de camp (PEAIC). L'objectiu general d'aquest treball va ser l'estudi de l'efectivitat del tractament de polsos elèctrics d'alta intensitat de camp sobre el microorganisme patogen Staphylococcus aureus en llet, així com l'efecte resultant de la seva combinació amb l'addició d'agents antimicrobians. La inactivació de Staph. aureus deguda a l'aplicació de PEAIC es va estudiar mitjançant un disseny experimental de superfície de resposta en el que les variables independents van ésser el nombre, l'amplada i la polaritat de pols, la intensitat de camp i la quantitat de grassa de la llet. De mode similar, s'avaluà l'efecte de l'addició de nisina, lisozima, enterocina AS-48 i les seves combinacions juntament amb l'aplicació de PEAIC. En aquest darrer cas, es va observar el grau de destrucció en funció del temps de tractament, la intensitat de camp, la concentració i temps d'exposició a l'antimicrobià, el pH, la temperatura d'emmagatzemament i la seqüència dels tractaments. Es va determinar la vida útil en refrigeració (4ºC) de llet tractada amb PEAIC i antimicrobians a partir de l'evolució de la flora mesòfila, d'enterobactèries, de coliforms i dels patògens Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp. i Staphylococcus aureus. Es va comparar també l'evolució de la flora de llet pasteuritzada amb la de la llet sotmesa simultàniament a un escalfament moderat, l'addició d'antimicrobians i l'aplicació de PEAIC. En general, polsos bipolars o una major intensitat de camp, nombre o amplada de pols es va traduir en un menor nombre de cèl·lules viables de Staph. aureus. Ara bé, es va obtenir un màxim d'inactivació que oscil·là entre 6.3 i 7.1 μs d'amplada de pols en el rang de 50 a 150 polsos de 35 kV/cm. Al mateix temps, la interacció entre l'amplada i el nombre de polsos o la intensitat de camp van proporcionar diferents combinacions de les variables amb igual nivell de destrucció microbiana. La combinació de PEAIC amb l'addició a dosis subletals de nisina o enterocina AS-48 actuà de forma sinèrgica a la inactivació de Staph. aureus en llet al seu pH natural. Aquest efecte va ser encara superior quan es combinaren dos antimicrobians, com la nisina i la lisozima o la nisina i l' enterocina AS-48. La mescla de 300 IU/mL de lisozima y 1 IU/mL de nisina va produir prop de 6.4 cicles logarítmics de reducció quan s'aplicaren 1,200 μs de polsos bipolar de 6 μs d'amplada i 35 kV/cm. El tractament de llet amb PEAIC o PEAIC simultàniament amb l'addició d'antimicrobians va augmentar la seva vida útil en refrigeració. L'addició d'1 IU/mL de nisina i 300 IU/mL de lisozima va allargar la vida útil de la llet fins a 7 dies si es processava amb polsos de 6 μs d'amplada i 1,200 μs de temps de tractament a 35 kV/cm, no detectant-ne la presència dels patògens en estudi. La combinació de PEAIC, escalfament moderat a 55ºC durant 16 s i l'addició d'antimicrobians en llet crua va inactivar les enterobactèries i coliforms durant 4 dies i allargà l'emmagatzemament fins a 8 dies. En el cas particular d'augmentar la temperatura fins a 65ºC, la vida útil (26 dies) i la qualitat microbiològica de les mostres amb 20 IU/mL de nisina i tractades amb PEAIC va superar i millorar a la de la llet pasteuritzada a 75ºC durant 16 s. En conseqüència, el tractament simultani de llet amb antimicrobians, com la nisina, la lisozima, l'enterocina AS-48 o les seves combinacions, mitjançant PEAIC i/o un escalfament moderat del medi podria millorar la qualitat organolèptica de múltiples productes làctics a la vegada que asseguraria la seva qualitat microbiològica. === La leche se ha procesado tradicionalmente mediante el uso de calor para asegurar su calidadmicrobiológica y su estabilidad enzimática. Sin embargo, los cambios organolépticos y la pérdida decomponentes nutritivos inducidos por el calentamiento podrían minimizarse con el empleo detratamientos no térmicos, como los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC). El presentetrabajo tuvo como objetivo general estudiar la efectividad del tratamiento con PEAIC sobre lasupervivencia del patógeno Staphylococcus aureus en leche, así como el efecto resultante de sucombinación con substancias antimicrobianas.La inactivación de Staph. aureus debida a la aplicación de PEAIC se estudió mediante un diseñoexperimental de superficie de respuesta en el que las variables independientes fueron el número, anchuray polaridad de pulso, la intensidad de campo y el porcentaje de grasa de la leche. De modo similar, seevaluó el efecto individual y conjunto de la adición de nisina, lisozima, enterocina AS-48 o de suscombinaciones con la aplicación de PEAIC. En este último caso, se determinó el grado de destrucción enfunción del tiempo de tratamiento, la intensidad de campo, la concentración y tiempo de exposición alantimicrobiano, el pH, la temperatura de almacenamiento y la secuencia de tratamiento. Se determinó lavida útil en refrigeración (4ºC) de leche tratada con PEAIC y antimicrobianos a partir de la evolución de laflora mesófila, enterobacterias, coliformes y los patógenos Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp.y Staphylococcus aureus. Se comparó también la evolución de la flora de la leche pasteurizada con la deleche sometida simultáneamente a un calentamiento moderado, la adición de antimicrobianos y laaplicación de PEAIC.En general, pulsos bipolares o una mayor intensidad de campo, número o anchura de pulsos se tradujo enun menor número de células viables de Staph. aureus. Si bien, se obtuvo un máximo de inactivación queosciló entre 6.3 y 7.1 μs de anchura de pulso en el rango de 50 a 150 pulsos a 35 kV/cm. Al mismo tiempo,la interacción entre la anchura de pulsos y el número de pulsos o la intensidad de campo definió distintascombinaciones de las variables con igual nivel de destrucción microbiana. La combinación de PEAIC con laadición a dosis subletales de nisina o enterocina AS-48 actuó de forma sinérgica en la inactivación deStaph. aureus en leche a su pH natural. Este efecto fue aún mayor cuando se combinaron dosantimicrobianos, como nisina y lisozima o nisina y enterocina AS-48. La combinación de 300 IU/mL delisozima y 1 IU/mL de nisina redujo la población hasta 6.4 ciclos logarítmicos cuando se aplicaron 1,200 μscon pulsos bipolares de 6 μs de anchura y 35 kV/cm. El tratamiento de leche con PEAIC o PEAIC junto a laadición de antimicrobianos alargó su vida útil en refrigeración. La adición 1 IU/mL de nisina y 300 IU/mLde lisozima la aumentó hasta 7 días si se procesaba con pulsos de 6 μs de anchura y 1,200 μs de tiempode tratamiento a 35 kV/cm, no detectándose, además, la presencia de los patógenos en estudio. Lacombinación de PEAIC, calentamiento moderado a 55ºC durante 16 s y adición de antimicrobianos enleche cruda consiguió inactivar a enterobacterias y coliformes durante 4 días y prolongar sualmacenamiento hasta 8 días. En el caso particular de aumentar la temperatura hasta 65ºC, la vida útil (26días) y la calidad microbiológica de muestras con 20 IU/mL de nisina y tratadas con PEAIC superó y mejorórespecto a la de la leche pasteurizada a 75ºC durante 16 s.En consecuencia, el tratamiento simultáneo de leche con antimicrobianos, tales como nisina, lisozima,enterocina AS-48 o sus combinaciones, mediante PEAIC y/o un calentamiento moderado del medio podríamejorar la calidad organoléptica de los productos lácteos a la par que asegurar su calidad microbiológica. === Milk has been traditionally processed by thermal treatments that assure their microbiological acceptance and enzimatical stability. However, changes of sensory properties induced by heating may be minimized by using nonthermal treatments, such as the use of high-intensity pulsed-electric field (HIPEF). Thus, the main purpose of this work was to study the lethal effect of applying high-intensity pulsed-electric field against Staphylococcus aureus inoculated in milk, as well as the effect of combining HIPEF with the addition of antimicrobial compounds. Cell death of Staph. aureus was studied by a response surface methodology, in which the independent variables were pulse number and width, pulse polarity, electric field intensity and fat content. Similarly, the joint effect of the addition of nisin, lysozyme, enterocin AS-48 or their combination with the application of HIPEF was also considered by varying the HIPEF treatment time, electric field intensity, concentration and exposure time to the antimicrobials, pH, storate temperature and the sequence of application. Shelf-life of milk treated by HIPEF and added antimicrobial compounds was determined. A microbial screening of mesophilic bacteria, enterobacteria, coliforms and the pathogens Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp. and Staphylococcus aureus was performed periodically during refrigerated storage. Fate of survivors of pasteurized milk was compared to that of milk submitted to mild heating, HIPEF and added antimicrobials. In general, the highest microbial inactivation was shown setting bipolar pulses or by increasing field intensity or pulse number and width. However, a maximum on cell death was observed depending on pulse width, which varied from 6.3 to 7.1 μs when pulse number ranged from 50 to 150 pulses, respectively, at 35 kV/cm of field intensity. Likewise, different levels of pulse width and pulse number or pulse width and field intensity reached the same level of inactivation. The combination of HIPEF with the addition of antimicrobial peptides (nisin, enterocina AS-48, nisin with lysozyme and nisin with enterocina AS-48) at sublethal doses acted synergistically against Staph. aureus in milk at its natural pH. A reduction over 6.4 log cycles was registered when 300 IU/mL of lysozyme and 1 IU/mL of nisin were added to milk prior to treating by HIPEF (1,200 μs treatment time and 6 μs pulse width at 35 kV/cm). Shelf-life of milk processed by HIPEF or by combining HIPEF and the addition of antimicrobial compounds was prolonged under refrigeration conditions. Milk with added 300 IU/mL of lysozyme and 1 IU/mL of nisin and treated by HIPEF (1,200 μs treatment time and 6 μs pulse width at 35 kV/cm) was stored for 7 days before reaching the limit of microbial acceptance. Moreover, absence of the considered pathogens was found on the latter treated samples. Counts of enterobacteria and coliforms remained below the detection limit during 4 days of storage at 4ºC and shelf-life prolonged for 8 days when milk was submitted to HIPEF, mild heating at 55ºC for 16 s and the addition of antimicrobial compounds. In the particular case of increasing temperature up to 65ºC, shelf-life (26 days) and microbial counts of milk with 20 IU/mL was longer and lower than milk pasteurized at 75ºC for 16 s. In conclusion, milk and dairy products simultaneously processed by the addition of antimicrobial peptides, such as nisin, lysozyme, enterocina AS-48 or their combination, mild heating and HIPEF may improve their sensory properties while microbial acceptance is assured.